Microarrays de anticuerpos: reconocimiento molecular para la detección de biomarcadores

Los biosensores basados en la especificidad de reconocimiento biológico (bio-afinidad) se han desarrollado ampliamente para la detección de biomarcadores (ácidos nucleicos, proteínas, lípidos u otros metabolitos). Tanto el ADN y las proteínas como las micro y nanotecnologías permiten la unión covalente de miles de sondas en una pequeña zona de un soporte sólido (plástico, vidrio, micro y nano-esferas, etc). Los volúmenes de reacción pequeños y la cinética de reacción elevada, junto con el gran potencial para la miniaturización y la robotización, hace que la tecnología de microarrays un sistema de gran alcance para el análisis in situ de los biomarcadores en la astrobiología y el monitoreo ambiental.

El reconocimiento molecular de los sistemas de bio-afinidad, tales como la reacción específica entre antígenos y anticuerpos, receptores de proteinas y ligandos, o la complementaria entre los ácidos nucleicos de una sola hebra, se han utilizado ampliamente en la industria de biosensores. De hecho, los biosensores más empleados en aplicaciones ambientales utilizan anticuerpos, debido a la disponibilidad de muchos de ellos contra los contaminantes específicos.Hay miles de anticuerpos comerciales producidos contra compuestos que van desde pequeñas moléculas tales como aminoácidos, azúcares y lípidos, a grandes polímeros y células enteras.

Anticuerpos para la exploración planetaria

Los anticuerpos son grandes glicoproteínas que se pueden modificar químicamente (por otras sustancias, como fluorocromos, otras proteínas, o incluso otros anticuerpos), sin afectar a la capacidad de unión y especificidad del anticuerpo a su antígeno. Además de los anticuerpos, hay otros tipos de moléculas de captura específicas: lectinas, un grupo de proteínas no enzimáticas con altas especificidades y afinidades para mono y oligosacáridos; affybodies, proteínas de unión seleccionadas in vitro; aptámeros, oligonucleótidos seleccionados in vitro que se unen; o los polímeros impresos molecularmente (MIPs), polímeros orgánicos formados en la presencia de una molécula que se extrae después, dejando así cavidades complementarias atrás.

Las matrices de anticuerpos (u otras moléculas de captura de bio-afinidad) son excelentes técnicas complementarias a otra como GC-MS o electroforesis capilar, en la exploración planetaria. Algunas de las principales ventajas de los microarrays de anticuerpos son las siguientes:

Se pueden ejecutar simultáneamente múltiples ensayos paralelos a la vez.
En un mismo ensayo se puede comprobar la presencia de cientos de moléculas.
Se puede detectar una amplia gama de tamaños moleculares, desde tamaño aa hasta células.
No hay calibración externa especial o normas necesarias para el ensayo.
Se pueden incorporar muchos controles positivos y negativos y analizarse al mismo tiempo que las muestras.
Rango de sensibilidad de ppb a ppm.
Los resultados son muy fáciles de analizar. Los biomarcadores putativos se identifican debido a la especificidad de las sondas y su ubicación predeterminada. Los anticuerpos reaccionan sólo con aquellas moléculas que contienen epítopos con estructuras tridimensionales iguales o muy similares a los utilizados para producir los anticuerpos, lo que significa que es posible obtener resultados inequívocos.

Estabilidad de los anticuerpos para la exploración planetaria

Los anticuerpos pueden ser macromoléculas altamente estables cuando se mantienen en condiciones apropiadas. Varios parámetros tales como la naturaleza del disolvente, la temperatura, la liofilización, congelación, sales, luz, o la etapa de injerto pueden afectar a la estructura tridimensional de los anticuerpos y por consiguiente a la afinidad por sus antígenos. Aparte de eso, la exploración planetaria requiere anticuerpos funcionales bajo condiciones de radiación penetrante de baja energía, microgravedad, ciclos de temperatura con sus variaciones, etc. La industria farmacéutica ha desarrollado métodos para la estabilidad de anticuerpo y es bien sabido que la mayoría de anticuerpos mantienen su actividad durante años cuando se congelan (entre -20 º C y -80 º C) en una solución salina o liofilizada y se mantiene esa temperatura en un ambiente protegido de la luz. Por lo general, se añaden estabilizantes tales como azúcares/polioles para reducir la degradación de los componentes activos durante el procesamiento y almacenamiento. La liofilización en presencia de azúcares (sacarosa o trehalosa) se utiliza comúnmente para proporcionar estabilidad de almacenamiento a largo plazo a los productos farmacéuticos de proteínas. Se cree que las proteínas alcanzan un estado vítreo amorfo altamente viscoso con una baja movilidad molecular y baja reactividad. Bajo tal estado la estabilidad es altamente dependiente de la temperatura de almacenamiento. El almacenamiento a temperaturas superiores a la temperatura de transición vítrea (normalmente aprox. 50 º C) hace que el material cristalino se vuelven menos viscoso, es decir la movilidad molecular aumenta y la estabilidad disminuye.

Los anticuerpos también se pueden conservar por secado a temperatura ambiente y a presión atmosférica en presencia de trehalosa u otras formulaciones. Hemos determinado experimentalmente que los arrays de anticuerpos impresos en portaobjetos de microscopio son estables (manteniendo más del 90 % de su funcionalidad) durante más de 9 meses almacenados a temperatura ambiente, incluso a 37ºC en presencia de soluciones estabilizantes desarrolladas por CAB y por la empresa Biotools SA (De Diego-Castilla et al., 2011). Los anticuerpos marcados con fluorescencia y liofilizados son estables durante más de 50 ciclos de temperatura (4 h cada uno) de -20 a +50 º C, e incluso después de una exposición de 150 Gy de radiación penetrante de baja energía (De Diego – Castilla et al. , 2011) (Gy = gray. Una gray es la absorción de un julio de energía de radiación por un kilogramo de materia). De acuerdo con nuestros resultados, Thompson et al., (2006) reportó que no se encontró alteración significativa en las longitudes de onda de absorción y de emisión o en los rendimientos cuánticos de dos colorantes fluorescentes, después de una radiación de protones e iones de Helio. Maule et al. (2003) demuestra que el nivel de una unión antígeno-anticuerpo no presenta variación entre la microgravedad, la gravedad marciana y las condiciones de gravedad de la Tierra.

Biomarcadores moleculares target para la producción de anticuerpos

Nuestra hipótesis asume que si alguna vez existió vida en Marte o en otros lugares, los organismos que se ocupan de las condiciones ambientales de Marte deben contener mecanismos moleculares similares que aquellos que viven en condiciones similares en la Tierra. Por consiguiente, nuestra estrategia para probar la presencia de la vida o de sus restos, consiste en la producción de anticuerpos contra microorganismos enteros, componentes específicos o bioquímicos obtenidos a partir de entornos terrestres analógos a Marte, compuestos bioquímicos que son comunes a muchos tipos diferentes de microorganismos (nucleótidos , azúcares, aminoácidos, vitaminas y coenzimas, etc), o bien otros macromoléculas evolucionarias conservadas como algunas proteínas, polisacáridos, o secuencias de polinucleótidos. Muchas de estas moléculas pueden ser consideradas como buenos biomarcadores moleculares y su detección en algún lugar sería indicio de vida real o reciente (Parro et al., 2008). Hemos producido, probado y validado un microarray de anticuerpos que contiene más de 300 anticuerpos para aplicaciones ambientales y astrobiológicas (Rivas et al. 2008; Parro et al., 2011).

Análogos terrestres

En la Tierra, es posible encontrar vida en prácticamente todos los lugares donde se puede encontrar agua líquida. Y muchas veces el agua líquida o rastros de ella se produce en lugares conocidos como ambientes extremos. Estos son creados por la permanente existencia de valores extremos en algunos parámetros físico-químicos como, temperatura, presión, pH, potencial redox, radiación, contenido de agua, salinidad, etc. Desde el punto de vista terrestre, Marte y el satélite Europa de Júpiter son ambientes extremos en los que varios o todos los parámetros mencionados parecen estar muy lejos de los valores “normales” en muchos lugares del planeta. Uno de los principales enfoques para estudiar la posibilidad y las posibles características de la vida extraterrestre es estudiar la vida en condiciones extremas en la Tierra. Por lo tanto, el estudio de los análogos terrestres de Marte puede servir como modelo útil al menos para comprender las principales características de la vida marciana, si existió alguna vez. Nos centramos principalmente en tres entornos que podrían compartir muchas características físico-químicas a las que se cree que existen en Marte: Hidrotermal, rico en ácidos y hierro, y el permafrost. La idea de estudiar la biología existente en entornos de subsuelo se ve reforzada por la sugerente evidencia de actividad hidrotermal en Marte en un pasado relativamente reciente. Sin embargo, si Marte es aún geológicamente activo, tema aún por determinar. Bien puede haber regiones bajo la superficie donde el agua líquida esté disponible, y donde las condiciones locales podrían apoyar el crecimiento de una flora y fauna autóctona. Si la vida microbiana alguna vez existió en Marte, probablemente el metabolismo del hierro juegue un papel central, como fuente de energía y para la formación de los componentes estructurales (metaloproteínas). Las regiones polares terrestres son excelentes análogos a muchos lugares de la superficie de Marte debido a que ambos están sometidos a esfuerzos similares. Este es el caso de Dry Walleys en la Antártida, lugares extremadamente fríos y secos, con muy bajo contenido de materia orgánica y microbiana.

Ambientes altamente oxidantes ácidos ricos en metales

Tanto MarsExpress (ESA) como MER (Mars Exploration Rover, de NASA), han reportado resultados que encajan con la presencia de agua en el Marte primitivo. Los datos obtenidos indican que algunas grandes regiones de Marte estaban cubiertas con agua. El MER proporcionó evidencias de la presencia de minerales que sólo se pueden formar en entornos acuosos en el Meridiani Planum. Existían argumentos suficientes para pensar que el agua perteneció a un océano ácido ancestral. Recientemente, el OMEGA («Observatoire pour la Minéralogie, l’Eau, les Glaces et l’Activité”) instrumento de la sonda MarsExpress confirmó la existencia de un amplio y representativo sistema acuoso-sulfatado como el de Meridiani Planum. La acidez puede ser la razón por la cual grandes cantidades de carbonatos no se han detectado todavía ya que estas condiciones químicas no son adecuados para su producción. Como se explica en un modelo reciente, el SO₂ se erupcionó de los volcanes deben desempeñar un papel como el CO₂ en la Tierra, creando un efecto invernadero que permite que el agua permanezca líquida (océanos ácidos) por cientos de años. Por lo tanto, es posible acumular sulfatos de detección (MER) en lugar de carbonatos. Es muy interesante para la ciencia la exploración planetaria para estudiar los ambientes extremos terrestres que se asemejan a los ecosistemas planetarios hipotéticos. De esta manera los depósitos del Tinto de las épocas y Holoceno Plio-Pleistoceno son similares a los sulfatos y sedimentos ricos en hematita descubiertos por el rover Opportunity en Meridiani Planum.

Los organismos quimiolitoautótrofos terrestres obtienen energía de la oxidación de moleculas inorganicas reducidas donantes de electrones en sus entornos. Los microorganismos acidófilos (pH 0,8 a 2,3), que viven en las mayores franjas de pirita del mundo (la cual se encuentra en la Península Ibérica, en la cuenca del río Tinto), como Leptospirillum ferrooxidans y Acidithiobacillus ferrooxidans, tienen un mínimo de requerimientos nutricionales. Sólo necesitan Fe₂+ como fuente de energía, CO₂, N₂ y O₂, como fuente de carbono, nitrógeno y aceptor de electrones, respectivamente, una parte de agua y sales minerales para hacer su metabolismo. Por otra parte, A. ferrooxidans tiene un comportamiento versátil durante su crecimiento en presencia de Fe₂+/O₂ o H₂/O₂ (condiciones aeróbicas; Fe₂+ y H₂, donantes de electrones; O₂ aceptor de electrones), así como en presencia de H₂/Fe₃+, H₂/SO, o SO/Fe₃+ (condiciones anaeróbicas; SO y H₂, donantes de electrones; Fe₃+ y SO aceptores de electrones). Aunque L. ferrooxidans es una bacteria aeróbica estricta, es capaz de sobrevivir en condiciones anaeróbicas durante largos períodos de tiempo y exhibe una alta tasa metabólica cuando el nivel de oxígeno es menor que 15%. Por otra parte, se informó por los estudios de expresión génica con L. ferrooxidans que estas bacterias son de hecho polyextremophiles verdaderos, es decir, que pueden crecer en varias condiciones extremas: pH bajo (1,8), con alto contenido de metales (20 gL^-1 de Hierro), alto contenido de sal (> 80gL^-1 de SO₄=), o estrés oxidativo elevado.

Hipotéticamente, si los océanos ácidos y gases de CO₂ y SO₂ hubieran existido en el Marte primitivo, podrían haber proporcionado microorganismos con: hierro como fuente de energía, CO₂ como fuente de carbono, N₂ como fuente de nitrógeno y compuestos sulfurados como fuente de energía para las bacterias reductoras de azufre. Por otra parte, se sabe que la cantidad predicha de N₂ que contenía la atmósfera primitiva de Marte podría haber sido lo suficientemente alta como para permitir que microorganismos como Rhodobacter y Mesorhyzobium sp. fijaran el nitrógeno. Por otro lado, si bien carecemos de datos para esclarecer el origen, se cree que las trazas de metano que se han detectado en la atmósfera Marciana pueden haber sido liberadas por hipotéticas bacterias del subsuelo. Por lo tanto, la tira de pirita de la Península Ibérica sigue constituyendo un modelo espléndido, ya que mantiene la actividad metanogénica subterránea, así como en varias zonas del río del Tinto. Hoy en día la comunidad científica espera encontrar señales de vida pasada o presente, relacionadas con microorganismos que vivían en el subsuelo ya que las radiaciones subterránea pasadas se cree que eran incompatibles con la vida tal como es conocida en la Tierra.

Ambientes hidrotermales

A finales de 1970 fueron descubiertos sistemas hidrotermales en el mar profundo, y ahora se sabe que representan una de las principales vías para la transferencia de calor en el interior de nuestro planeta, y que actúan como los principales mecanismos de transporte de productos químicos en los océanos. Los ciclos de energía biológica quimiosintética alrededor de los sistemas hidrotermales son de particular interés, ya que tienen implicaciones para el origen de la vida misma. Los métodos de análisis químico en estos entornos remotos han dependido por necesidad, de la toma de muestras en la profundidad que luego se han transferido a un buque en la superficie y/o después se han analizado en una base en tierra. Esto está lejos de ser ideal, debido a los grandes cambios de presión, temperatura, oxigenación, etc. de la muestra con respecto a antes del análisis. Por otro lado, este dilema oceanográfico reduce la dignidad de problemas de control de muestreo remotos en otros planetas a un problema del orden de tamaño más que ser un obstáculo como tal. El objetivo a largo plazo es en la Tierra, también, sustituir los análisis de laboratorio por controles in situ en la medida de lo posible. La fuente de energía más accesible para los microorganismos en la litosfera del planeta terrestre es el hidrógeno molecular (H₂) que se forma durante la oxidación de Fe(II) inherente a los minerales. Una de los minerales Fe(II) más fácilmente degradado es olivino. Esta es una solución sólida del Mg mineral forsterita (Mg₂SiO₄) con una contribución menor (10-20%) de mineral Fe (II) fayalita (Fe₂SiO₄) Olivino 45% (SiO₂) de la parte superior.

Ambientes Helados

Muchas cianobacterias fotosintéticas y algas de regiones polares están sometidas a entornos extremos y sintetizan biomoléculas para hacer frente a estas condiciones. Estos extremos son bajas temperaturas, altas variaciones de temperatura, alta radiación solar y períodos de desecación. Los polisacáridos, por ejemplo, se sintetizan para hacer frente a la desecación y también se sintetizan compuestos como escitonemina para lidiar con el estrés de radiación UV. Las tensiones que se pueden encontrar en Marte son similares a los encontrados en las regiones polares de la Tierra. Por lo tanto, los organismos de las regiones polares proporcionan excelentes sistemas modelo para la comprensión de las respuestas de supervivencia de cualquier biota putativo en condiciones marcianas y pueden proporcionar información sobre los tipos de biomoléculas producidas por microorganismos en respuesta a estas tensiones ambientales en Marte. Por ejemplo, Chroococcidiopsis spp, es una cianobacteria extremófila, que existe de forma natural en el hábitat endolítico de los desiertos fríos y calientes del mundo, ésta se encuentra en forma de bandas coherentes de organismos que crecen en los entornos cercanos a la superficie de las rocas. Este género es resistente a la desecación e incluso a la radiación ionizante, este último aspecto también es importante para los organismos en la superficie de Marte que está expuesta a un flujo de radiación ionizante mucho mayor de lo que estaría en la Tierra.

Desiertos extremadamente secos

Durante años, el desierto de Atacama ha sido utilizado por diferentes grupos de investigación dentro de la NASA como un análogo de Marte. El desierto de Atacama es uno de los análogos terrestres más precisos para entornos de Marte, ya que combina la formación de dos compuestos inorgánicos clave: cloruros y percloratos. Al igual que sucede en Marte, las duras y áridas condiciones promovieron una sobresaturación extrema de las soluciones de agua superficiales y subterráneas que dieron lugar a la precipitación casi exclusiva de halita, el miembro final de la evaporación de las salmueras, sin otra fase mineral. Las regiones limítrofes del Salar Grande (Cordillera de la Costa, Región de Atacama, Chile) se caracterizan por subsuelos salinos asociados con depósitos de nitrato que contienen cloruros, sulfatos, cloratos, cromatos, yodatos y percloratos. Durante julio del 2009 se realizó una campaña astrobiológica de campo, “AtacaMars2009”, donde se probó SOLID3 y LDChip300 y se estudió la geomicrobiología del subsuelo de Atacama en el lado oeste del Salar Grande (Parro et al., 2011).

Antibody microarrays: molecular recognition for biomarker detection

Biosensors based on the specificity of biological recognition (bio-affinity) have been extensively developed for biomarker detection (nucleic acids, proteins, lipids, other metabolites). DNA and protein micro and nanotechnologies allow covalent binding of thousands of probes in a small area on a solid support (plastic, glass, micro and nano-spheres, etc). Smaller reaction volumes and higher reaction kinetics, together with the great potential for miniaturization and robotizing, makes microarray technology a powerful system for in situ analysis of biomarkers in astrobiology as well as environmental monitoring.

Molecular recognition by bio-affinity systems, such as the highly specific reaction between antigens and antibodies, protein receptors and ligands, or the complementary between single-stranded nucleic acids, have been extensively used in biosensor industry. In fact, the most employed biosensors for environmental applications used antibodies, due to the availability of many of them against specific contaminants. There are thousands of commercial antibodies raised against compounds ranging from small molecules such as amino acids, sugars, and lipids, to large polymers and whole cells.

Antibodies for planetary exploration

Antibodies are large glycoproteins that can be chemically modified (by other substances, like fluorochromes, other proteins, or even other antibodies), without affecting the binding capacity and specificity of the antibody to its antigen. Apart from antibodies there are other types of specific capturing molecules: lectins, a group of nonenzymatic proteins with high specificities and affinities for mono and oligosaccharides; affybodies, in vitro selected binding proteins; aptamers, in vitro selected binding oligonucleotides; or the molecularly imprinted polymers (MIPs), organic polymers formed in the presence of a molecule that is extracted afterwards, thus leaving complementary cavities behind.

Antibody (or other bio-affinity capturing molecules) arrays are excellent complementary techniques to others like GC-MS or capillary electrophoresis, for planetary exploration. Some important strengths of the antibody microarrays are:

Multiple parallel assays at a time can be run simultaneously.
The presence of hundreds of molecules can be tested in one assay.
Broad range of molecular sizes can be detected, from aa size to cells.
No special external calibration or standards required for the assay.
Many negative and positive controls can be incorporated and analyzed at the same time as samples.
Sensitivity from ppb to ppt.
Results are very easy to analyze. Putative biomarkers are identified due to the specificity of the probes and their predetermined location. Antibodies only react with those molecules containing epitopes with three-dimensional structures equal or highly similar to those used to produce the antibodies, which means that it is possible to get unambiguous results.

Stability of the antibodies for planetary exploration

Antibodies can be high stable macromolecules when they are kept under appropriate conditions. Several parameters like the nature of the solvent, temperature, lyophilization, freezing, salts, light, or grafting step can affect the three-dimensional structure of antibodies and consequently the affinity for their antigens. Apart of that, planetary exploration requires functional antibodies under deeply penetrating low energy radiation, microgravity, temperature cycles and its variations, etc. The pharmaceutical industry has developed methods for antibody stability and it is well known that most antibodies maintain their activity for years when frozen (between –20 ºC and –80 ºC) in a saline solution or lyophilized and kept at ambient temperature protected from light. Usually stabilizers such as sugars/polyols are added to reduce the degradation of active components during processing and storage. Lyophilization in the presence of sugars (sucrose or trehalose) is commonly used to provide long-term storage stability to protein pharmaceuticals. It is believed that proteins reach a highly viscous amorphous glassy state with low molecular mobility and low reactivity. Under such state the stability is highly dependent on storage temperature. Storage at temperatures above the glass transition temperature (usually ca. 50 ºC) the glassy material become less viscous, the molecular mobility increases and the stability decreases.

Antibodies can also be preserved by drying at ambient temperature and at atmospheric pressure in the presence of trehalose or other formulations. We have experimentally determined that printed antibody arrays on microscope slides are stable (keeping more than 90 % of their functionality when compared to time zero) for more than 9 months stored at room temperature, even at 37 ºC in the presence of stabilizing solutions developed by CAB and by the company Biotools S.A. (De Diego-Castilla et al., 2011). Fluorescently labeled and lyophilized antibodies are stable over more than 50 temperature cycles (24 h each) of –20 to +50 ºC, and even after an exposure of 150 Gy of high penetrating low energy radiation (De Diego-Castilla et al., 2011) (Gy=gray. One gray is the absorption of one joule of radiation energy by one kilogram of matter). In agreement with our results, Thompson et al., (2006) have reported that no significant alteration in the absorption and emission wavelengths or the quantum yields of two fluorescent dyes was found after a proton and helium ion radiation. Maule et al. (2003) showed that the level of an antibody-antigen binding did not differ between microgravity, Martian gravity and Earth’s gravity conditions.

Molecular biomarker targets for antibody production

Our hypothesis assume that if life ever existed on Mars or elsewhere, the organisms dealing with the Martian environmental conditions must contain similar molecular mechanisms that those living under similar conditions on Earth. Consequently, our strategy for testing the presence of life or its remains consists in the production of antibodies against whole microorganisms, specific components or biochemicals obtained from terrestrial analog environments to Mars, to biochemical compounds which are common to many different types of microorganisms (nucleotides, sugars, aminoacids, vitamins and coenzymes, etc), or other well evolutionary conserved macromolecules like some proteins, polysaccharides, or polynucleotide sequences. Many of these molecules can be considered good molecular biomarkers and their detection somewhere would be indicative of the actual or recent live (Parro et al., 2008). We have produced, tested and validate an antibody microarray containing more than 300 antibodies for both environmental and astrobiology applications (Rivas et al. 2008; Parro et al., 2011).

Terrestrial analogues

On Earth, It is possible to find life in practically all those places where one can find liquid water. And many times liquid water or traces of it occurs in places known as extreme environments. These are created because of the permanent existence of extreme values of certain physico-chemical parameters like, temperature, pressure, pH, redox potential, radiation, water content, salinity, etc. From a terrestrial point of view, Mars and the Jupiter’s satellite Europa are extreme environments where several or all of the mentioned parameters seem to be very far from “normal” values in many places of the planet. One of the main approaches to study the possibility and the possible features of extraterrestrial life is to study life in extreme conditions on Earth. Thus, the study of several terrestrial analogues for certain Mars environments can serve as useful models at least to understand the main features of martian life if ever existed. We mainly focus on three environments that could share many physico-chemical characteristics to others thought to exist on Mars: Hydrothermal, acid and iron rich, and permafrost. The idea of subsurface environments for extant biology is strengthened by evidence suggestive of hydrothermal activity on Mars in the relatively recent past. However, whether Mars is still geologically active is not yet determined. There may well be subsurface regions where liquid water is available, and where the local conditions might support the growth of an indigenous biota. If microbial life ever existed on Mars, probably iron metabolism played a central role both as energy source and for the formation of structural components (metalloproteins). Earth Polar Regions are excellent analogues to many places of Mars surface because both are subjected to similar stresses. This is the case of the Antarctic Dry Walleys, extremely cold and dry places, with very low microbial and organic content.

Acidic, metal-rich, highly oxidant environments

Both MarsExpress (by ESA) and MER (Mars Exploration Rovers, by NASA), have reported results that link with the presence of water in the primitive Mars. The obtained data indicate that several large regions of Mars were covered with water, as well as the MER in the Meridiani Planum provided us with evidences of the presence of minerals that can only be formed in presence aqueous environment. There were arguments enough to think that the water belonged to an ancestral acidic ocean. Recently, the OMEGA (“Observatoire pour la Minéralogie, l’Eau, les Glaces et l’Activité”) instrument of the Mars Express probe confirmed the existence of a large and representative aqueous-sulphated systems like in the Meridiani Planum. The acidity might be the reason why large amounts of carbonates have not been detected yet since these chemical conditions are not suitable for its production. As explained in a recent model, the SO₂ erupted from volcanoes should play a role like the CO₂ on Earth by creating a greenhouse effect which allow the water to remain liquid (acidic oceans) for hundred of years. Thus, it is possible to accumulate sulphates (MER detection) instead of carbonates. It is very interesting for the planetary exploration science to study the terrestrial extreme environments that resemble hypothetical planetary ecosystems. Thereby the Tinto’s deposits of the Holocene and Plio-Pleistocene epochs are similar to the sulphates and hematite rich sedimentary rocks discovered by the Opportunity rover in the Meridiani Planum.

Terrestrial chemolithoautotrophs organisms obtain energy by the oxidation of electron donating inorganic reduced molecules in their environments. The acidophilic (pH 0.8-2.3) microorganisms living in the world’s largest pyrite strip (located in the Iberian Peninsula, Tinto River basin), like Leptospirillum ferrooxidans and Acidithiobacillus ferrooxidans, have a minimal nutritional requirements. They only need Fe₂+ as source of energy, CO₂, N₂ and O₂ as source of carbon, nitrogen and electron acceptor respectively, a part of water and mineral salts to make their metabolism runs. Moreover, A. ferrooxidans has a versatile behaviour while growing in presence of Fe₂+/O₂ or H₂/O₂ (aerobic conditions; Fe₂+ and H₂, electron donors; O₂ electron acceptor) as well as in presence of H₂/Fe₃+, H₂/SO, or SO/Fe₃+ (anaerobic conditions; SO and H₂, electron donors; Fe₃ y SO electron acceptors). Although L. ferrooxidans is a strict aerobic bacterium, it is capable of surviving in anaerobic conditions over long periods of time and it exhibits at high metabolic rate when the level of oxygen is lower than 15%. Moreover, we reported by gene expression studies with L. ferrooxidans that these bacteria are in fact true polyextremophiles, that is, they can grow under several extreme conditions: low pH (1.8), high metal content (20 gL^-1 of Iron), high salt content (>80 g L^-1 of SO₄=), or high oxidative stress.

Hypothetically, if the acidic oceans and CO₂ and SO₂ gases existed on the primitive Mars, they could have provided microorganisms with: Iron as energy source, CO₂ as carbon source, N₂ as nitrogen source, and sulphured compounds as energy source for sulphur-reducer bacteria. Moreover, it has been reported that the predicted amount of N₂ in the primitive Martian atmosphere could have been high enough to allow microorganisms like Rhodobacter y Mesorhyzobium sp. to fix the nitrogen. On the other hand, although we lack of data to clarify the origin, the traces of methane that have been detected in the Martian atmosphere are thought to be released by the hypothetical methanogenic bacteria in the subsoil. Therefore, the pyritic strip in the Iberian Peninsula still constitutes a splendid model since it holds methanogenic activity underground as well as in several zones of the Tinto’s river. Nowadays the scientific community hopes to find signs of past or present life related to microorganisms which lived in the subsoil since the radiations above underground are believed incompatibles with life as it is known on Earth.

Hydrothermal environments

Deep sea hydrothermal systems were only discovered on Earth in the late 1970s but are now known to represent one of the major pathways for transfer of heat in our planet’s interior as well as representing one of the major chemical transport mechanisms to the oceans. Of particular interest are the chemosynthetic biological energy cycles around the hydrothermal systems, which have implications for the origin of life itself. Methods of chemical analysis in these remote environments have, by necessity, depended on collecting samples at depth which are then transferred to a surface ship and/or land-based for analysis. This is far from ideal, because of subjection of the sample to exceptionally large changes in pressure, temperature, oxygenation, etc prior to analysis. On the other hand, this oceanographic dilemma reduces the dignity of problems of remote sampling control on other planets to a problem of the size order more than being an obstacle as such. The long-term goal is on Earth, as well, to replace laboratory analyses by in situ monitoring as far as possible. The most easily accessible source of energy for micro-organisms in the lithosphere of terrestrial planets is the molecular hydrogen (H₂) that is formed during oxidation of Fe(II) inherent in minerals. One of the most easily weathered Fe(II) minerals is olivine. This is a solid solution of the Mg mineral forsterite (Mg₂SiO₄) with a minor contribution (10-20%) of the Fe(II) mineral fayalite (Fe₂SiO₄) Olivine 45% (SiO₂) of the upper part

Icy environments

Many photosynthetic cyanobacteria and algae from the Polar Regions are subjected to great environmental extremes and they synthesize biomolecules to cope with these conditions. These extremes include low temperatures, extreme temperature variations, high solar radiation and periods of desiccation. Polysaccharides, for instance, are synthesized to deal with desiccation and compounds such as scytonemin are synthesized to deal with UV radiation stress. The stresses to be found on Mars are similar to those found in the polar regions of the Earth. Thus, organisms from Polar Regions provide excellent model systems for understanding survival responses of any putative biota to Martian conditions and may provide insights into the types of biomolecules produced by micro-organisms in response to Martian environmental stresses. For example, Chroococcidiopsis spp, an extremophilic cyanobacterium, exists naturally in the endolithic habitat in both hot and cold deserts of the world, being found as coherent bands of organisms growing in the near-surface environment of the rocks. This genus is resistant to desiccation and even ionizing radiation, the latter extreme also being important for organisms on the surface of Mars that will be exposed to a much higher ionizing radiation flux than they would be on Earth.

Extremely Dry Deserts

For years, the Atacama desert has been used by different research groups within NASA as a Mars analogue. The Atacama desert is one of the most accurate terrestrial analogues for Mars environments because it combines the formation of two key inorganic compounds: chlorides and perchlorates. Similar to events on Mars, harsh arid conditions promoted an extreme oversaturation of the ground and surface water solutions that resulted in nearly-exclusive precipitation of halite, the end-member in evaporation from brines, with no other mineral phase. The bounding regions of the Salar Grande (Cordillera de la Costa, región de Atacama, Chile) are characterized by saline subsoils associated with nitrate deposits containing chlorides, sulfates, chlorates, chromates, iodates, and perchlorates. During July 2009 we performed an astrobiological field campaign, “AtacaMars2009,” where we tested SOLID3 and LDChip300 and study the geomicrobiology of the Atacama subsurface at the west side of the Salar Grande (Parro et al., 2011).