CIENCIA

Microarrays de anticuerpos: reconocimiento molecular para la detección de biomarcadores

Los biosensores basados en la especificidad de reconocimiento biológico (bio-afinidad) se han desarrollado ampliamente para la detección de biomarcadores (ácidos nucleicos, proteínas, lípidos u otros metabolitos). Tanto el ADN y las proteínas como las micro y nanotecnologías permiten la unión covalente de miles de sondas en una pequeña zona de un soporte sólido (plástico, vidrio, micro y nano-esferas, etc). Los volúmenes de reacción pequeños y la cinética de reacción elevada, junto con el gran potencial para la miniaturización y la robotización, hace que la tecnología de microarrays un sistema de gran alcance para el análisis in situ de los biomarcadores en la astrobiología y el monitoreo ambiental.

El reconocimiento molecular de los sistemas de bio-afinidad, tales como la reacción específica entre antígenos y anticuerpos, receptores de proteinas y ligandos, o la complementaria entre los ácidos nucleicos de una sola hebra, se han utilizado ampliamente en la industria de biosensores. De hecho, los biosensores más empleados en aplicaciones ambientales utilizan anticuerpos, debido a la disponibilidad de muchos de ellos contra los contaminantes específicos.Hay miles de anticuerpos comerciales producidos contra compuestos que van desde pequeñas moléculas tales como aminoácidos, azúcares y lípidos, a grandes polímeros y células enteras.

Anticuerpos para la exploración planetaria

Los anticuerpos son grandes glicoproteínas que se pueden modificar químicamente (por otras sustancias, como fluorocromos, otras proteínas, o incluso otros anticuerpos), sin afectar a la capacidad de unión y especificidad del anticuerpo a su antígeno. Además de los anticuerpos, hay otros tipos de moléculas de captura específicas: lectinas, un grupo de proteínas no enzimáticas con altas especificidades y afinidades para mono y oligosacáridos; affybodies, proteínas de unión seleccionadas in vitro; aptámeros, oligonucleótidos seleccionados in vitro que se unen; o los polímeros impresos molecularmente (MIPs), polímeros orgánicos formados en la presencia de una molécula que se extrae después, dejando así cavidades complementarias atrás.

Las matrices de anticuerpos (u otras moléculas de captura de bio-afinidad) son excelentes técnicas complementarias a otra como GC-MS o electroforesis capilar, en la exploración planetaria. Algunas de las principales ventajas de los microarrays de anticuerpos son las siguientes:

  • Se pueden ejecutar simultáneamente múltiples ensayos paralelos a la vez.
  • En un mismo ensayo se puede comprobar la presencia de cientos de moléculas.
  • Se puede detectar una amplia gama de tamaños moleculares, desde tamaño aa hasta células.
  • No hay calibración externa especial o normas necesarias para el ensayo.
  • Se pueden incorporar muchos controles positivos y negativos y analizarse al mismo tiempo que las muestras.
  • Rango de sensibilidad de ppb a ppm.
  • Los resultados son muy fáciles de analizar. Los biomarcadores putativos se identifican debido a la especificidad de las sondas y su ubicación predeterminada. Los anticuerpos reaccionan sólo con aquellas moléculas que contienen epítopos con estructuras tridimensionales iguales o muy similares a los utilizados para producir los anticuerpos, lo que significa que es posible obtener resultados inequívocos.

Estabilidad de los anticuerpos para la exploración planetaria

Los anticuerpos pueden ser macromoléculas altamente estables cuando se mantienen en condiciones apropiadas. Varios parámetros tales como la naturaleza del disolvente, la temperatura, la liofilización, congelación, sales, luz, o la etapa de injerto pueden afectar a la estructura tridimensional de los anticuerpos y por consiguiente a la afinidad por sus antígenos. Aparte de eso, la exploración planetaria requiere anticuerpos funcionales bajo condiciones de radiación penetrante de baja energía, microgravedad, ciclos de temperatura con sus variaciones, etc. La industria farmacéutica ha desarrollado métodos para la estabilidad de anticuerpo y es bien sabido que la mayoría de anticuerpos mantienen su actividad durante años cuando se congelan (entre -20 º C y -80 º C) en una solución salina o liofilizada y se mantiene esa temperatura en un ambiente protegido de la luz. Por lo general, se añaden estabilizantes tales como azúcares/polioles para reducir la degradación de los componentes activos durante el procesamiento y almacenamiento. La liofilización en presencia de azúcares (sacarosa o trehalosa) se utiliza comúnmente para proporcionar estabilidad de almacenamiento a largo plazo a los productos farmacéuticos de proteínas. Se cree que las proteínas alcanzan un estado vítreo amorfo altamente viscoso con una baja movilidad molecular y baja reactividad. Bajo tal estado la estabilidad es altamente dependiente de la temperatura de almacenamiento. El almacenamiento a temperaturas superiores a la temperatura de transición vítrea (normalmente aprox. 50 º C) hace que el material cristalino se vuelven menos viscoso, es decir la movilidad molecular aumenta y la estabilidad disminuye.

Los anticuerpos también se pueden conservar por secado a temperatura ambiente y a presión atmosférica en presencia de trehalosa u otras formulaciones. Hemos determinado experimentalmente que los arrays de anticuerpos impresos en portaobjetos de microscopio son estables (manteniendo más del 90 % de su funcionalidad) durante más de 9 meses almacenados a temperatura ambiente, incluso a 37ºC en presencia de soluciones estabilizantes desarrolladas por CAB y por la empresa Biotools SA (De Diego-Castilla et al., 2011). Los anticuerpos marcados con fluorescencia y liofilizados son estables durante más de 50 ciclos de temperatura (4 h cada uno) de -20 a +50 º C, e incluso después de una exposición de 150 Gy de radiación penetrante de baja energía (De Diego – Castilla et al. , 2011) (Gy = gray. Una gray es la absorción de un julio de energía de radiación por un kilogramo de materia). De acuerdo con nuestros resultados, Thompson et al., (2006) reportó que no se encontró alteración significativa en las longitudes de onda de absorción y de emisión o en los rendimientos cuánticos de dos colorantes fluorescentes, después de una radiación de protones e iones de Helio. Maule et al. (2003) demuestra que el nivel de una unión antígeno-anticuerpo no presenta variación entre la microgravedad, la gravedad marciana y las condiciones de gravedad de la Tierra.


Biomarcadores moleculares target para la producción de anticuerpos

Nuestra hipótesis asume que si alguna vez existió vida en Marte o en otros lugares, los organismos que se ocupan de las condiciones ambientales de Marte deben contener mecanismos moleculares similares que aquellos que viven en condiciones similares en la Tierra. Por consiguiente, nuestra estrategia para probar la presencia de la vida o de sus restos, consiste en la producción de anticuerpos contra microorganismos enteros, componentes específicos o bioquímicos obtenidos a partir de entornos terrestres analógos a Marte, compuestos bioquímicos que son comunes a muchos tipos diferentes de microorganismos (nucleótidos , azúcares, aminoácidos, vitaminas y coenzimas, etc), o bien otros macromoléculas evolucionarias conservadas como algunas proteínas, polisacáridos, o secuencias de polinucleótidos. Muchas de estas moléculas pueden ser consideradas como buenos biomarcadores moleculares y su detección en algún lugar sería indicio de vida real o reciente (Parro et al., 2008). Hemos producido, probado y validado un microarray de anticuerpos que contiene más de 300 anticuerpos para aplicaciones ambientales y astrobiológicas (Rivas et al. 2008; Parro et al., 2011).

Análogos terrestres

En la Tierra, es posible encontrar vida en prácticamente todos los lugares donde se puede encontrar agua líquida. Y muchas veces el agua líquida o rastros de ella se produce en lugares conocidos como ambientes extremos. Estos son creados por la permanente existencia de valores extremos en algunos parámetros físico-químicos como, temperatura, presión, pH, potencial redox, radiación, contenido de agua, salinidad, etc. Desde el punto de vista terrestre, Marte y el satélite Europa de Júpiter son ambientes extremos en los que varios o todos los parámetros mencionados parecen estar muy lejos de los valores «normales» en muchos lugares del planeta. Uno de los principales enfoques para estudiar la posibilidad y las posibles características de la vida extraterrestre es estudiar la vida en condiciones extremas en la Tierra. Por lo tanto, el estudio de los análogos terrestres de Marte puede servir como modelo útil al menos para comprender las principales características de la vida marciana, si existió alguna vez. Nos centramos principalmente en tres entornos que podrían compartir muchas características físico-químicas a las que se cree que existen en Marte: Hidrotermal, rico en ácidos y hierro, y el permafrost. La idea de estudiar la biología existente en entornos de subsuelo se ve reforzada por la sugerente evidencia de actividad hidrotermal en Marte en un pasado relativamente reciente. Sin embargo, si Marte es aún geológicamente activo, tema aún por determinar. Bien puede haber regiones bajo la superficie donde el agua líquida esté disponible, y donde las condiciones locales podrían apoyar el crecimiento de una flora y fauna autóctona. Si la vida microbiana alguna vez existió en Marte, probablemente el metabolismo del hierro juegue un papel central, como fuente de energía y para la formación de los componentes estructurales (metaloproteínas). Las regiones polares terrestres son excelentes análogos a muchos lugares de la superficie de Marte debido a que ambos están sometidos a esfuerzos similares. Este es el caso de Dry Walleys en la Antártida, lugares extremadamente fríos y secos, con muy bajo contenido de materia orgánica y microbiana.

Ambientes altamente oxidantes ácidos ricos en metales

Tanto MarsExpress (ESA) como MER (Mars Exploration Rover, de NASA), han reportado resultados que encajan con la presencia de agua en el Marte primitivo. Los datos obtenidos indican que algunas grandes regiones de Marte estaban cubiertas con agua. El MER proporcionó evidencias de la presencia de minerales que sólo se pueden formar en entornos acuosos en el Meridiani Planum. Existían argumentos suficientes para pensar que el agua perteneció a un océano ácido ancestral. Recientemente, el OMEGA («Observatoire pour la Minéralogie, l’Eau, les Glaces et l’Activité») instrumento de la sonda MarsExpress confirmó la existencia de un amplio y representativo sistema acuoso-sulfatado como el de Meridiani Planum. La acidez puede ser la razón por la cual grandes cantidades de carbonatos no se han detectado todavía ya que estas condiciones químicas no son adecuados para su producción. Como se explica en un modelo reciente, el SO2 se erupcionó de los volcanes deben desempeñar un papel como el CO2 en la Tierra, creando un efecto invernadero que permite que el agua permanezca líquida (océanos ácidos) por cientos de años. Por lo tanto, es posible acumular sulfatos de detección (MER) en lugar de carbonatos. Es muy interesante para la ciencia la exploración planetaria para estudiar los ambientes extremos terrestres que se asemejan a los ecosistemas planetarios hipotéticos. De esta manera los depósitos del Tinto de las épocas y Holoceno Plio-Pleistoceno son similares a los sulfatos y sedimentos ricos en hematita descubiertos por el rover Opportunity en Meridiani Planum.

Los organismos quimiolitoautótrofos terrestres obtienen energía de la oxidación de moleculas inorganicas reducidas donantes de electrones en sus entornos. Los microorganismos acidófilos (pH 0,8 a 2,3), que viven en las mayores franjas de pirita del mundo (la cual se encuentra en la Península Ibérica, en la cuenca del río Tinto), como Leptospirillum ferrooxidans y Acidithiobacillus ferrooxidans, tienen un mínimo de requerimientos nutricionales. Sólo necesitan Fe2+ como fuente de energía, CO2, N2 y O2, como fuente de carbono, nitrógeno y aceptor de electrones, respectivamente, una parte de agua y sales minerales para hacer su metabolismo. Por otra parte, A. ferrooxidans tiene un comportamiento versátil durante su crecimiento en presencia de Fe2+/O2 o H2/O2 (condiciones aeróbicas; Fe2+ y H2, donantes de electrones; O2 aceptor de electrones), así como en presencia de H2/Fe3+, H2/SO, o SO/Fe3+ (condiciones anaeróbicas; SO y H2, donantes de electrones; Fe3+ y SO aceptores de electrones). Aunque L. ferrooxidans es una bacteria aeróbica estricta, es capaz de sobrevivir en condiciones anaeróbicas durante largos períodos de tiempo y exhibe una alta tasa metabólica cuando el nivel de oxígeno es menor que 15%. Por otra parte, se informó por los estudios de expresión génica con L. ferrooxidans que estas bacterias son de hecho polyextremophiles verdaderos, es decir, que pueden crecer en varias condiciones extremas: pH bajo (1,8), con alto contenido de metales (20 gL-1 de Hierro), alto contenido de sal (> 80gL-1 de SO4=), o estrés oxidativo elevado.

Hipotéticamente, si los océanos ácidos y gases de CO2 y SO2 hubieran existido en el Marte primitivo, podrían haber proporcionado microorganismos con: hierro como fuente de energía, CO2 como fuente de carbono, N2 como fuente de nitrógeno y compuestos sulfurados como fuente de energía para las bacterias reductoras de azufre. Por otra parte, se sabe que la cantidad predicha de N2 que contenía la atmósfera primitiva de Marte podría haber sido lo suficientemente alta como para permitir que microorganismos como Rhodobacter y Mesorhyzobium sp. fijaran el nitrógeno. Por otro lado, si bien carecemos de datos para esclarecer el origen, se cree que las trazas de metano que se han detectado en la atmósfera Marciana pueden haber sido liberadas por hipotéticas bacterias del subsuelo. Por lo tanto, la tira de pirita de la Península Ibérica sigue constituyendo un modelo espléndido, ya que mantiene la actividad metanogénica subterránea, así como en varias zonas del río del Tinto. Hoy en día la comunidad científica espera encontrar señales de vida pasada o presente, relacionadas con microorganismos que vivían en el subsuelo ya que las radiaciones subterránea pasadas se cree que eran incompatibles con la vida tal como es conocida en la Tierra.

Ambientes hidrotermales

A finales de 1970 fueron descubiertos sistemas hidrotermales en el mar profundo, y ahora se sabe que representan una de las principales vías para la transferencia de calor en el interior de nuestro planeta, y que actúan como los principales mecanismos de transporte de productos químicos en los océanos. Los ciclos de energía biológica quimiosintética alrededor de los sistemas hidrotermales son de particular interés, ya que tienen implicaciones para el origen de la vida misma. Los métodos de análisis químico en estos entornos remotos han dependido por necesidad, de la toma de muestras en la profundidad que luego se han transferido a un buque en la superficie y/o después se han analizado en una base en tierra. Esto está lejos de ser ideal, debido a los grandes cambios de presión, temperatura, oxigenación, etc. de la muestra con respecto a antes del análisis. Por otro lado, este dilema oceanográfico reduce la dignidad de problemas de control de muestreo remotos en otros planetas a un problema del orden de tamaño más que ser un obstáculo como tal. El objetivo a largo plazo es en la Tierra, también, sustituir los análisis de laboratorio por controles in situ en la medida de lo posible. La fuente de energía más accesible para los microorganismos en la litosfera del planeta terrestre es el hidrógeno molecular (H2) que se forma durante la oxidación de Fe(II) inherente a los minerales. Una de los minerales Fe(II) más fácilmente degradado es olivino. Esta es una solución sólida del Mg mineral forsterita (Mg2SiO4) con una contribución menor (10-20%) de mineral Fe (II) fayalita (Fe2SiO4) Olivino 45% (SiO2) de la parte superior.

Ambientes Helados

Muchas cianobacterias fotosintéticas y algas de regiones polares están sometidas a entornos extremos y sintetizan biomoléculas para hacer frente a estas condiciones. Estos extremos son bajas temperaturas, altas variaciones de temperatura, alta radiación solar y períodos de desecación. Los polisacáridos, por ejemplo, se sintetizan para hacer frente a la desecación y también se sintetizan compuestos como escitonemina para lidiar con el estrés de radiación UV. Las tensiones que se pueden encontrar en Marte son similares a los encontrados en las regiones polares de la Tierra. Por lo tanto, los organismos de las regiones polares proporcionan excelentes sistemas modelo para la comprensión de las respuestas de supervivencia de cualquier biota putativo en condiciones marcianas y pueden proporcionar información sobre los tipos de biomoléculas producidas por microorganismos en respuesta a estas tensiones ambientales en Marte. Por ejemplo, Chroococcidiopsis spp, es una cianobacteria extremófila, que existe de forma natural en el hábitat endolítico de los desiertos fríos y calientes del mundo, ésta se encuentra en forma de bandas coherentes de organismos que crecen en los entornos cercanos a la superficie de las rocas. Este género es resistente a la desecación e incluso a la radiación ionizante, este último aspecto también es importante para los organismos en la superficie de Marte que está expuesta a un flujo de radiación ionizante mucho mayor de lo que estaría en la Tierra.

Desiertos extremadamente secos

Durante años, el desierto de Atacama ha sido utilizado por diferentes grupos de investigación dentro de la NASA como un análogo de Marte. El desierto de Atacama es uno de los análogos terrestres más precisos para entornos de Marte, ya que combina la formación de dos compuestos inorgánicos clave: cloruros y percloratos. Al igual que sucede en Marte, las duras y áridas condiciones promovieron una sobresaturación extrema de las soluciones de agua superficiales y subterráneas que dieron lugar a la precipitación casi exclusiva de halita, el miembro final de la evaporación de las salmueras, sin otra fase mineral. Las regiones limítrofes del Salar Grande (Cordillera de la Costa, Región de Atacama, Chile) se caracterizan por subsuelos salinos asociados con depósitos de nitrato que contienen cloruros, sulfatos, cloratos, cromatos, yodatos y percloratos. Durante julio del 2009 se realizó una campaña astrobiológica de campo, «AtacaMars2009», donde se probó SOLID3 y LDChip300 y se estudió la geomicrobiología del subsuelo de Atacama en el lado oeste del Salar Grande (Parro et al., 2011).